一篇小文帶您玩轉(zhuǎn)顯微觀察方式

顯微鏡作為實(shí)驗室的常規(guī)設(shè)備，每天可見，其應(yīng)用也非常廣泛。小到微生物檢測，大到產(chǎn)品的外觀檢查，覆蓋了各個方面。可是，對于不同的顯微觀察方式，您真的了解嗎？在這篇小文中，我們就簡單扒一扒不同顯微觀察方式、優(yōu)缺點(diǎn)及各自的應(yīng)用范圍。

1.明場 BF

作為最常規(guī)的觀察方式，明場的應(yīng)用主要在于常規(guī)的鏡檢、組織、病理切片或者各類染色標(biāo)本的觀察。生物學(xué)專業(yè)的童鞋最熟悉的革蘭氏陽性菌和陰性菌的觀察，以及顯微計數(shù)等，都離不開這種觀察方式。

明場觀察的優(yōu)點(diǎn)是視野的亮度高、均勻；而且操作簡單，成本不高。是非常受歡迎的一類觀察方式。但同時也存在一些缺點(diǎn)，比如需要制片；物鏡工作距離短無法觀察較厚的樣本等問題。另外，如果是透明標(biāo)本，對比度較低，細(xì)節(jié)不易呈現(xiàn)。當(dāng)然，這種觀察方式也看不到樣本的立體結(jié)構(gòu)。

2.暗場 DF

它的特點(diǎn)和明場不同，不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此，視場成為黑暗的背景，而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的像。一般用于微小粒子、細(xì)菌形態(tài)、透明標(biāo)本等的觀察。能夠觀察到極其微小的物體，其分辨率可達(dá)0.4um，反差大。

這種觀察方式不太多見，只能觀察到物體存在、運(yùn)動和外部形態(tài)等，對標(biāo)本的要求也比較高。

3.相差觀察 PH

利用被檢物體的光程差進(jìn)行鏡檢，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹睢？捎糜诨铙w細(xì)胞觀察、無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)等。一般配置在倒置顯微鏡上，是鑒定活體細(xì)胞最實(shí)用、最經(jīng)濟(jì)的方法。可使細(xì)胞樣本產(chǎn)生一些立體感。

但是，這種觀察方式需要的光強(qiáng)較高，且切片不能太厚，需要控制在5~10um。操作有點(diǎn)麻煩，熒光效果不如明場物鏡。在高倍下會產(chǎn)生光暈，影響成像效果。

4.偏光觀察 POL

偏光觀察的原理是依據(jù)波動光學(xué)原理觀察和精密測定標(biāo)本細(xì)節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù)，以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)。這種觀察方式成像一般非常漂亮。

但僅適用于具有雙折射性的物質(zhì)，比如礦物質(zhì)、化學(xué)物品鑒別；鑒別纖維、染色體、淀粉粒、晶體；植物病理檢驗、骨骼、牙齒；膽固醇、神經(jīng)纖維、以及毛發(fā)等。

5.微光干涉 DIC

微分干涉原理是通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強(qiáng)度相等的光束，光束在極近的兩點(diǎn)（小于顯微鏡的分辨率）上通過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺。這種觀察方式最直接的效果就是產(chǎn)生立體感。可應(yīng)用于觀察無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，立體感好、分辨率高

無色熒光標(biāo)本，染色標(biāo)本成像，以及用于顯微操作等。

其缺點(diǎn)是需要的光強(qiáng)較高，雙折射物質(zhì)不能做DIC鏡檢。細(xì)胞培養(yǎng)客戶最關(guān)心的細(xì)胞觀察，需要使用底部為玻璃的器皿進(jìn)行DIC觀察。

6.浮雕相稱 IMC

IMC觀察的原理比較簡單，利用斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射，光線通過物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察對比度。 這種觀察方式經(jīng)濟(jì)實(shí)用，不限被觀察樣本的材質(zhì)，可用于塑料皿的觀察，調(diào)節(jié)也很方便。

可以用于胞質(zhì)內(nèi)精子注、IVF和細(xì)胞觀察。

成像特點(diǎn)是圖像顯示陰影或近似三維結(jié)構(gòu)而不會產(chǎn)生光暈。可用于雙折射物質(zhì)的檢測，也可用于檢測玻璃、塑料等培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，但分辨率不如DIC高。同時Leica專利的物鏡可同時用于明場、暗場和熒光觀察，使用方便。

7.熒光觀察

什么是熒光呢？熒光就是物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。

顯微鏡下的熒光觀察也是比較常用的觀察方式。生物學(xué)中的熒光探針有三種類型：自發(fā)熒光、熒光染料以及熒光蛋白。其中自發(fā)熒光一般是天然的，無法控制，通常是令人討厭的。熒光染料明亮且光譜范圍大，相對穩(wěn)定，應(yīng)用范圍較寬，但是用于特異性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)蛋白時比較困難；熒光蛋白的優(yōu)點(diǎn)包括通過融合目標(biāo)蛋白可以在活細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；可以作為結(jié)構(gòu)破壞的靶；對一些環(huán)境參數(shù)敏感；缺點(diǎn)是波長選擇有限，低光穩(wěn)定性，光譜交叉，基團(tuán)相對龐大等。

熒光探針通常被應(yīng)用于定位、研究蛋白間相互作用、空間結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞環(huán)境報道、基因表達(dá)報道等。對于細(xì)胞培養(yǎng)的客戶，熒光通常用于染色區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)成分染色等。

以上圖片來自于Leica Microsystems。

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